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腫瘤細胞轉移主要包括以下5個過程:

原位侵襲(Local invasion),

腫瘤細胞內滲(Intravasation),

循環系統存活(Survival in the circulation),

腫瘤細胞外滲(Extravasation),

形成轉移灶(Micrometastasis formation)等。


其中細胞侵襲發生在第一步,即腫瘤細胞在原位突破基底膜,然后內滲進入血管、淋巴管的過程。其侵襲性是腫瘤相關信號通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學研究的一個重要指標。


(腫瘤細胞轉移過程,來源DOI:10.1016/j.cell.2011.09.024)


腫瘤細胞侵襲實驗通常利用細胞小室(常用6孔、12孔、24孔板等)進行檢測。


與腫瘤細胞遷移實驗不同的是,需在聚碳酸酯膜上側鋪一層基質膠,用以模仿細胞外基質。

腫瘤細胞必須分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)消化基質才能進入下室,更好的模擬了動物體內的情況。


侵襲實驗過程

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a. 基質膠包被:

(a) 將基質膠置于冰中并在4℃融化,使用預冷的移液管或吸頭混合基質膠至均勻狀態。
(b) 在冰上,將基質膠用無血清培養液按照1:8的比例進行稀釋,例如取8μl基質膠加入64μl不含血清的培養液中,使用預冷的吸頭混合至均勻狀態。

注:常用的稀釋比例為1:4、1:6、1:8,可根據實驗具體情況調整稀釋比例。
(c) 取60μL上述混合溶液垂直加入細胞小室中,使其均勻平鋪在底部。

(d) 吸出未結合的基質膠。

(e) 加入100μl不含血清的培養液,將培養板置于37℃培養箱孵育30分鐘,進行水化。
(f) 去除小室中液體,檢查是否有液體穿過小室進入到下室中,若沒有,則可用于接種細胞。


b. 細胞懸液的制備:
(a) 對細胞進行12-24小時的饑餓處理。(非必需步驟)
(b) 消化細胞,用不含血清的培養液重懸,調整細胞密度為5-50萬個/mL。


c. 細胞接種:
(a) 取500μL含10% FBS的培養液加入24孔板下室,用鑷子將細胞小室置于24孔板內。

(b) 取200μL細胞懸液加入細胞小室。
(c) 將24孔板置于培養箱中培養24-48小時。


d. 細胞固定、染色:
(a) 取出細胞小室,去除培養液,用棉簽輕輕擦拭基質膠及細胞。
(b) 在24孔板干凈的孔中加入600μl 4%多聚甲醛固定液,將小室放入固定20-30分鐘。
(c) 棄固定液,PBS洗滌小室1次。

(d) 在24孔板干凈的孔中加入適量結晶紫染色液,將小室放入染色5-10分鐘。
(e) 取出小室,PBS洗滌3次。

(f) 適當風干后,顯微鏡下觀察并計數。


除細胞侵襲實驗外,基質膠可被用于類器官培養、干細胞分化、血管生成、體內腫瘤發生等多項研究。




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